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生物载体介导基因进入并整合到植物基因组上的方法
发表日期:2019/7/25       点击:124
报告基因
报告基因通常是植物体内没有的、易于在离体条件或活体条件下检测的酶, 这些酶的编码区可以和目的基因编码区融合,从而产生具有酶活的融合蛋白。这些融合蛋白可以提供目的基因表达的定量和组织器官定位的信息。常见的报告基 因有从大肠杆菌分离出的|3-葡萄糖醛酸糖苷酶基因讲s A,从萤火虫分离出的 荧光素酶基因he和从水母分离出的绿色荧光蛋白基因等。
A基因产物GUS即可以用荧光测定也可以进行组织化学染色定位。荧
第十一章植物转基因技术
图11-1植物转基因流程图
光测定用4-甲基伞形酮葡糖苷酸(4-MUG)为底物,该方法测定简单、快速、 灵敏度髙。组织化学染色定位以5 _溴_ 4氯-3 _吲哚葡萄糖苷酸(X-gluc)为
底物。
GFP的检测简单,无需底物和辅助因子,只需紫外或蓝光照射,即可发出 绿色荧光。因此便于活体检测,在表达产物示踪和细胞定位的研究中发挥了很大 的作用。
4.转化方法
就植物转基因技术而言可以根据转化系统的原理分为3大系统:载体转化技
第十一章植物转基因技术
术、直接转化技术和种质转化技术。.下面分别简述。
⑴载体转化技术
载体转化技术是指通过农杆菌的Ti或Ri质粒,植物病毒的DNA或RNA等 生物载体介导基因进入并整合到植物基因组上的方法。其中土壤农杆菌转化系统 是目前研究最为清楚而且转化最成功的方法。由于此法可采用植物的多种组织作 为基因转移的受体,操作简单、转化率较高,转化后目标基因的表达和遗传规律 与其他方法比相对稳定,因此这种方法最常用。对病毒载体转化系统的研究也取 得了一些成就。 '
土壤农杆菌是一类侵染受伤植物并且形成冠瘿瘤的革兰氏阴性菌。它的致瘤 能力来源存在于细胞内的Ti (tumour-induced)质粒。它利用Ti质粒控制植物细 胞来生产自己独特的“食品” _冠瘿碱,从而将植物细胞转变成特定营养的安全 避难所和工厂。Ti质粒长200 ~250kb,上面分布着四个区:T-DNA (transferee! DNA), VzV (virulence gene),控制结合转移的区域和与冠癭碱利用有关的基因 区。毒力基因即V7r基因控制着转移DNA即T-DNA向植物细胞转移,T-DNA 是唯一整合进植物基因组的区域,它编码植物激素和冠瘿碱合成酶。T-DNA转 化植物的过程如下:植物受伤后分泌并释放信号分子,是即一类小分子酚类化合 物,如乙酿丁香銅(acetosyringoneAS)或轻基乙醜丁香銅(OH-AS),农杆菌对 植物酚类化合物具有趋化性,同时高浓度的AS可使农杆菌的Vir基因活化和表 达。植物细胞的细胞膜上的AS受体蛋白(VirA)感受并自身磷酸化被刺激,然 后将磷酸基团转移给Vir区基因调控蛋白因子ViiG。VirG调控着下游基因的表 达,来完成T-DNA的切割,包装和转移。首先VirD与25bp边界序列结合,使 边界序列松弊,然后VirD2特异剪切T-DNA成单链,再与T-DNA的5'端共价 结合。加上VirE2,此复合物可以避免被核酸酶降解。在VirB的作用下,同时 还提供能量,跨过各种膜,最后整合进入染色体。过程如图11-2所示。
Ti质粒载体系统主要有共整合载体系统和双元载体系统。共整合载体系统 是利用含T-DNA的大肠杆菌小质粒插入目的基因后转到含天然Ti质粒的农杆菌 中进行同源重组将目的基因插到Ti质粒中。双元载体系统是目的基因克隆于含 T-DNA的大肠杆菌小质粒中,转移所需的Vir基因由缺失T-DNA的Ti质粒反 式提供。农杆菌对植物的感染有以下几种方法:①活体接种法:把新鲜培养的农 杆菌接种到植株的伤口部位,从而诱发肿瘤形成。造成伤口的方法有刀切、针 刺、微粒轰击等。②共培养法:农杆菌与原生质体或悬浮细胞或愈伤组织共培养 转化。③叶盘法:将植物的叶片、子叶或根等切成小片或打孔取叶盘,农杆菌浸 染后进行筛选和鉴定。
Ri质粒可以诱导毛状根,毛状根经过激素处理可以分化成可育的成体植株。 由于对Ri质粒了解还不多,现在利用Ri质粒转化系统的比较少,主要用于研究
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